酵母雙雜交載體應用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個蛋白間沒有發生相互作用的情況下，報告基因被激活。
主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，則也可單獨激活報告基因的表達。
因此，為排除假陽性就需要作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統都采用了多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區各不相同，這可減少大量的假陽性。
另外，報告基因通常整合到染色體上，可以使基因表達水平穩定，消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。
即使根據嚴格的對照實驗證明確實發生了蛋白間的相互作用，還應對以下方面進行分析:
(1)這種相互作用是否會在細胞內自然發生，即這一對蛋白在細胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達且定位在同一區域。
(2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。
(3)一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個親a-螺旋的蛋白質間可以發生相互作用。十年來，酵母雙雜交技術一直在消除假陽性方面不斷改進，并且已取得較好的效果〔2，3〕。
在酵母雙雜交的應用中有時也會遇到假陰性現象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應發生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來
〔4〕。造成假陰性的原因主要有兩方面:
一、是融合蛋白的表達對細胞有毒性。這時應該選擇敏感性低的菌株或拷貝數低的載體。
二、是蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現象雖不是實驗中的主要問題，但也應予以重視。
轉化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進行篩選時，必須提高轉化效率。
轉化時可采用共轉化或依次轉化，相比之下共轉化省時省力。更重要的是如果單獨轉化會發生融合表達蛋白對酵母細胞的毒性時，共轉化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉入不同接合型的單倍體酵母中，通過兩種接合型單倍體細胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細胞。