Luc 報(bào)告基因底物/ D-Luciferin D-螢火蟲(chóng)熒光素鉀鹽

活體成像研究/體外生物發(fā)光研究/轉(zhuǎn)錄水平研究（金標(biāo)產(chǎn)品，享發(fā)文獎(jiǎng)勵(lì)）《促xiao中》

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搜索關(guān)鍵詞：

Luc reporter gene 報(bào)告基因；In vivo imaging 活體成像研究；轉(zhuǎn)錄水平研究；熒光素酶/ATP水平研究；報(bào)告基因質(zhì)粒；報(bào)告基因病毒顆粒；螢火蟲(chóng)熒光素；甲蟲(chóng)熒光素；CAS：115144-35-9；

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內(nèi)活體成像技術(shù)。作用機(jī)制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當(dāng)熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，導(dǎo)入研究動(dòng)物如大小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來(lái)檢測(cè)光強(qiáng)度變化，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對(duì)此反應(yīng)體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強(qiáng)度的變化來(lái)指示能量或生命體征。

基本應(yīng)用：

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報(bào)告基因分析；高通量測(cè)序和各種污染檢測(cè)。

常見(jiàn)商業(yè)化類型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：

目前市場(chǎng)上有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產(chǎn)品主要差別在于溶解特性。

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內(nèi)的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無(wú)毒性，特別適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)應(yīng)用上都沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒(méi)有差別，主要是使用習(xí)慣等因素影響。整體來(lái)看，鉀鹽的應(yīng)用文獻(xiàn)明顯多于鈉鹽。

D-熒光素鉀鹽基本特性：

1）CAS NO：115144-35-9

2）化學(xué)名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly, potassium salt

3）分子式：C11H7N2O3S2K

4）分子量：318.42 g/mol

5）純度：＞99% (HPLC)，分子生物學(xué)級(jí)（超純）

6）外觀：淺黃色至黃色粉末

7）溶解性：溶于水（60 mg/ml）

使用方法：

A．體外生物發(fā)光檢測(cè)

1）儲(chǔ)存液制備

用蒸餾水溶解D-熒光素（鉀鹽），配制成15mg/ml的儲(chǔ)存液（100×），混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。建議使用的工作液濃度為150µg/ml（相當(dāng)于468µM）。

2）熒光素酶反應(yīng)緩沖液制備

配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻(xiàn)資料來(lái)調(diào)整。按照以上配方制備熒光素酶反應(yīng)緩沖液（2×）。

3）收集細(xì)胞裂解上清（熒光素酶表達(dá)）

根據(jù)需要檢測(cè)的細(xì)胞類型，選擇合適的裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，離心收集上清后續(xù)檢測(cè)待用。

4）螢火蟲(chóng)熒光信號(hào)檢測(cè)

【注①】：螢火蟲(chóng)熒光信號(hào)的檢測(cè)方法大體上取決于冷光測(cè)定儀（luminometer）類型（是手動(dòng)型熒光計(jì)、單管注射型或者酶標(biāo)板讀數(shù)型熒光計(jì)）。根據(jù)特定發(fā)光測(cè)定儀，來(lái)考慮注射用量和程序設(shè)置。

【注②】：需設(shè)置不含熒光素酶的孔（用作陰性對(duì)照），以測(cè)定背景熒光。

例：注射式冷光測(cè)定儀（injectible luminometer，單樣或微孔板，200µl終體積）

a）吸取100µl熒光素酶反應(yīng)緩沖液（2×）到一干凈的冷光測(cè)定儀比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；

b）吸取50~98µl裂解上清到皿或孔內(nèi)；

c） 如果有需要，用水來(lái)補(bǔ)足使得總體積到198µl；

d）設(shè)置程序注射2µl熒光素儲(chǔ)存液（使工作濃度150µg/ml），程序：2~5秒延遲（delay），之后10s測(cè)定。

B．活體成像分析

1）用無(wú)菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-熒光素（鉀鹽）工作液（15mg/ml），0.2µm濾膜過(guò)濾除菌。混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復(fù)凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2）注射量取決于注射方式，具體如下：

3）注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號(hào)達(dá)到最qiang 穩(wěn)定平臺(tái)期），再進(jìn)行成像分析。

注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定最高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。

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